细胞冻存protocol

贴壁细胞冻存通用步骤

1）配置细胞冻存液（通用配方：70%基础培养基+20%血清+10%DMSO）；

2）选用生长状态好（90－95％），生长数量大于5×10⁵ 的细胞进行冻存；

3）细胞冻存24 小时前，须用新鲜细胞培养液培养24 小时；

4）弃去细胞培养液，用含双抗的1×PBS（pH7.4）清洗细胞培养瓶2 次；

5）将细胞消化液加入细胞培养瓶，轻轻摇动，使细胞消化液刚好完全覆盖细胞培养瓶瓶底；

6）弃去细胞培养液，用含双抗的1×PBS（pH7.4）清洗细胞培养瓶2 次；

7）将细胞培养瓶置于5%CO₂、95%空气、37^oC细胞培养箱1-2 分钟后，在显微镜下观察细胞的消化状态。如观察到贴壁细胞逐渐趋于圆形、少部分悬浮，则用手指轻轻拍打细胞培养瓶底部，直至大部分贴壁细胞悬浮，然后加入1ml 完全培养基（指含有血清的培养基），终止细胞消化；

8）将消化好的细胞悬液收集至15ml 离心管中；

9）细胞离心管在1000rpm 下离心5 分钟，小心弃上清液；

10）用细胞冻存液重悬后转移至细胞冻存管中，拧紧管盖。标注好细胞名称和冻存日期；

11）按室温→4℃（30 分钟）→ 冰箱冷冻室-20℃（30 分钟）→ 超低温冰箱（－80℃过夜）→ 液氮罐顺序降温保存细胞。

悬浮细胞冻存通用步骤

1）配置细胞冻存液（通用配方：70%基础培养基+20%血清+10%DMSO）；

2）选用生长状态好（90－95％），生长数量大于5×10⁵ 的细胞进行冻存；

3）细胞冻存24 小时前，须用新鲜细胞培养液培养24 小时；

4）将悬浮细胞转入离心管，1000rpm 下离心5 分钟，小心弃上清液；

5）加入适量PBS重悬细胞，1000rpm 下离心5 分钟，小心弃上清液；

6）用细胞冻存液重悬后转移至细胞冻存管中，拧紧管盖。标注好细胞名称和冻存日期；

7）按室温→4℃（30 分钟）→ 冰箱冷冻室-20℃（30 分钟）→ 超低温冰箱（－80℃过夜）→ 液氮罐顺序降温保存细胞。

通用配方说明：客户用什么培养基养的细胞，就用什么培养基配冻存液，比如要配10ml的1640冻存液，就可以取7ml1640+2mlFBS+1mlDMSO配成。