biotechne产品使用常见技术问题解答-Protein & Enzyme 蛋白及酶类

1.1 Recombinant Protein 重组蛋白


某些蛋白产品货号中的/ CF后缀是什么意思? CF是carrier free的简称,代表“无载体蛋白”。通常,我们的重组蛋白产品中每1μg蛋白加50μg BSA(载体蛋白)装瓶,以增强稳定性。 通常含有BSA的蛋白比不含载体的对应产品可以在更低的浓度下储存,并且有更长的保质期。当需要将蛋白添加到培养基中或用 作ELISA标准品时,优先购买含有BSA的版本。无载体蛋白的产品更适用于如下情况:体内实验,标记蛋白质,或其它BSA可能造 成干扰的应用。


部分重组蛋白中含有Fc,其作用是什么? Fc是免疫球蛋白IgG中的Fc片段,可用于构建重组蛋白Fc嵌合体(Chimera)。 重组蛋白中Fc有多种功能:它可方便重组蛋白的纯化,在结合实验中方便抗IgG抗体对重组蛋白检测,或促进形成二硫键连接的同源二聚体,从而增加某些重组蛋白的生物活性和稳定性。


重组蛋白中的GST标签或者Fc该如何去除?   GST标签在N端并且可以通过PreScission蛋白酶(Amersham Biosciences)去除。 Fc通常可以使用Factor Xa缓冲液去除。 具体Protocol可以凭借购买信息,联系技术支持索取。


产品说明书显示应储存在-20ºC。收到货为常温运输,会影响产品活性吗? 冻干粉产品在环境温度(Ambient)下运输,不会受到影响。冷冻干燥可以提高蛋白产品的稳定性,同时减少包装材料和运输费用。我们对冻干产品的运输条件进行过测试,只要按照说明书显示的正常运输条件(Shipping Conditions)进行运输,产品活性不会受影响。需要注意的是由于终端用户可能会由代理商进行运输,客户收到货时需要检查是否按照正确的运输条件。例如许多酶类产品需要干冰运输,代理商短暂使用冰块运输也有可能导致酶失活。收到产品后对运输条件有疑问的,请当场拍下照片并尽快与我们联系确认。


为何收到的蛋白产品像是空瓶? 由于工艺原因,蛋白冻干粉产品会呈现粉末状或肉眼不易观察到的透明薄膜状、胶冻状,这些都是正常现象。此外,在运输过程 中,冻干颗粒可能会分散,并粘附于瓶壁和瓶盖。收到产品后,请按照冻干粉的重溶建议步骤,使用合适的缓冲液,重溶至说明书推荐的浓度,然后进行分装储存及使用。


COA中的装瓶日期(Date Bottled)与产品保质期有关吗? 这是一个常见问题,在R&D Systems®蛋白产品的COA中,我们按部分国家进口要求标注了装瓶日期。装瓶日期与产品的生产日期无关,也不是计算产品有效期或产品保质期的依据。具体产品有效期及质保政策请看相关问题的详细解答。


R&D Systems®蛋白产品的有效期(保质期)是多久? R&D Systems®制定了不限制产品使用期限的政策,将不会规定我们的蛋白质和抗体产品的失效期或生产日期。在适当的存储条件下,蛋白质和抗体可以保持稳定活性多年。这些条件包括以冻干粉形式存储蛋白质,以大于0.1 mg / mL的蛋白质浓度存储冷冻的 产品(-20°C或-80°C)以及限制冻融循环的次数。我司的常规质量控制测试可确保所有产品在销售时都具有可接受的生物活性。 在实验室的正常条件下使用时,R&D Systems®保证产品达到或超过我们提供的技术参数。 由于R&D Systems®无法控制终端用户的存储条件。通常,保质期为自购买之日起6-12个月。若有特殊要求,请参见各产品说明书 及COA中Stability&Storage一栏。如果产品在规定的期限内出现问题,我们将提供质保。若有不清楚的情况,欢迎联系技术支持。


液体形式和冻干粉形式对蛋白的效期有什么影响? 我司蛋白产品,无论以液体形式还是以冻干粉形式提供,在官网指示的保存条件下,均保证产品的质量。通常,冻干粉形式的蛋白产品,可保存更长的时间。


哪些蛋白会以液体形式提供给客户? 蛋白以何种形式提供给客户,通常由生产部门决定。大包装(Bulk)或者定制(Customize)产品购买时可以选择液体或者冻干粉形式。常规产品,具有酶活性的蛋白通常为液体形式,小包装的蛋白或抗体也常见液体形式。实际以产品COA中Formulation 说明为准,如果客户有明确需求,订购时可以提出,与我们核实后发货。


R&D Systems®蛋白冻干粉产品重溶建议使用哪种等级的BSA? R&D Systems®使用Probumin®Media Grade BSA(Millipore; Catalog# 81-068)或(Sigma; Catalog#A7030)进行蛋白质重溶。建议客户使用相同级别或等效的BSA。


贵司是否有蛋白重溶缓冲液产品出售? 由于蛋白及抗体产品的种类不同,可能需要不同的重溶缓冲液。我司提供一系列单独出售的重溶缓冲液产品(货号RB01-07), 客户可根据个人意愿购买,产品列表请参考链接:https://www.rndsystems.com/search?keywords=Reconstitution%2BBuffers


R&D Systems®蛋白产品是否是无菌(Sterile)的? 对于GMP产品我们可以提供详细的无菌测试报告。 对于仅供研究(RUO)类产品:尽管产品使用的是无菌技术包装,高温杀菌的容器以及无菌储存方案,但他们并不能保证是无菌的。如果实验需要确保无菌,可以根据实际情况使用针对生物液体的0.2微米过滤器进行过滤。 对于重溶后体积较小的蛋白产品,过滤会导致体积明显损失,请客户慎重考虑过滤的可行性。


贵司的重溶缓冲液是否经过无菌检测,用0.2 微米过滤器会有损失吗? 我司重溶缓冲液(货号RB01-07)进行常规 QC测定(含USP <61> 无菌测试),包括:1) 生物负载测试- 6天未长菌,2) 内毒素测 定 (标准为< 0.25EU/ml)。客户可以在无菌条件下对蛋白进行重溶及分装,如需要,可以对稀释后的工作液进行过滤,我司检测过滤对重溶缓冲液中蛋白成分的损失。 此外,针对特殊要求的客户,我司可提供有偿的额外检测认证(含USP <71> 无菌测试)。


为何一些蛋白冻干粉产品需要在酸性缓冲液中重溶?这会伤害细胞吗? 为了保证蛋白冻干粉产品完全的重溶并保持活性,请使用说明书建议的缓冲液重溶并储存。因为一些蛋白质在中性pH下极其疏 水,若不使用建议的缓冲液,这些蛋白质无法完全重溶,并且大部分会粘附在瓶壁。 通常重溶的储存液浓度远高于工作浓度,当蛋白储存液用于实验,可用培养基或其他合适的缓冲液将其稀释至工作浓度,这些缓 冲液会缓冲痕量的酸以保证蛋白安全用于细胞。


用0.2 微米生物液体过滤器过滤的蛋白溶液,损失率会有多少? 在蛋白产品重溶后,我司尚未评估用过滤器过滤后蛋白质的损失率。


如何重溶/复溶(Reconstitute)冻干粉蛋白?如何分装及保存? 除非说明书上有更具体的说明,我们建议采用以下方式: 1. 将试剂瓶和重溶缓冲液平衡至室温。 2. 短暂离心试剂瓶以确保在小瓶底部收集所有冻干物。 3. 加入推荐的重溶缓冲液,达到产品说明上推荐的浓度。避免剧烈振荡或移液器吹打,这可能导致蛋白质变性。 4. 使试剂瓶在室温下重溶15-30分钟,可使用360度摇床或手动轻轻上下颠倒确保充分重溶。 5. 我们建议使用无菌的聚丙烯管(Polypropylene)分装蛋白储存液,每管体积大于20μL分装,并按产品说明书上的指示储存。 如果小瓶内呈现薄片或颗粒,则在室温下将产品混合几小时,然后在4℃过夜。若产品依然无法溶解,请联系技术支持。


重溶要求避免剧烈振荡或移液器吹打,客户将空瓶离心是否属于此类? 剧烈震荡和吹打会对蛋白造成破坏,进而影响重溶后蛋白的活性。空瓶离心本身不属于剧烈震荡范畴,我们一般建议低速短暂离心(例如300×g,1min),不会对蛋白造成影响。这是重溶前的常规操作步骤,可以避免在瓶盖或者瓶壁的蛋白在开盖时洒出造成损失。


部分冻干粉蛋白或抗体产品,为何重溶后测得的质量显著低于标注质量? 可能的原因有: 1.检测方法差异,蛋白质量有多种检测方法,不同方法间存在一定的差异。 2.研究类产品质控要求通常为10%以内,由于客户重溶、测量等实验误差,确实会存在测得值与理论值差异超过10%的情况。 3.部分产品的质控信息不明确,例如IVD抗体原料类产品(货号ABT起始),此类产品没有公开的标准,需寻求总部帮助。 若多个产品或多种方法测量均出现此类情况,请联系技术支持。

蛋白定量方法中银染和考马斯亮蓝的区别考马斯亮蓝法:考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定 量测定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓 度范围较大,灵敏度为1-5μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 银染:基于蛋白质中各种基团(如琉基、碳基等)与银的结合,然后用还原剂如甲醛在碱性环境下使Ag+还原成银颗粒,可把蛋 白电泳带染成黑褐色。由于银染的灵敏度很高,可染出胶上低于1ng/蛋白质点,银染比传统考染灵敏度高100倍,被广泛用于蛋 白质组学研究。但是银染步骤复杂,繁琐,且着色线性动力学覆盖范围窄,容易导致蛋白质差异显示不准确。


Western Blot实验中推荐使用何种形式的蛋白产品? 推荐使用无载体蛋白BSA的蛋白产品,以免抗体非特异性结合载体蛋白BSA进而干扰重组蛋白的检测。此外还需要注意重组蛋白 的序列与WB一抗的结合位点是否匹配。


蛋白是否可用于体内实验(In vivo)?活性,半衰期及推荐浓度是多少? 我司蛋白类产品不进行任何体内测试。因此也没有这些产品在体内应用中的活性和半衰期数据。客户可以通过单击产品特定网页 上的“Citations”选项卡,找到体内使用的参考文献。我们建议使用无载体蛋白形式“CF”的蛋白质产品进行体内实验。我们对于功能性抗体提供内毒素水平数据。


使用Sf-21细胞进行蛋白质表达有什么好处? Sf-21细胞来自草地贪夜蛾。Sf-21细胞能够进行许多翻译后修饰,包括糖基化和磷酸化,尽管程度与哺乳动物细胞不同。


什么是海藻糖(Trehalose),它在配方中起什么作用? 海藻糖是一种非还原糖,在美拉德反应中不与氨基酸或蛋白质发生反应。它存在于自然界的许多植物和动物中。海藻糖可以稳定 蛋白质,防止冷冻造成的伤害,还可以使蛋白质在冻干时更耐水,从而使产品在重溶时产生沉淀的可能性更小。


海藻糖会影响连接反应(Conjugation)吗? 海藻糖的存在可能会干扰蛋白质的成功结合。 这将取决于连接的方法,客户最好在购买产品之前做相关研究。


如果产品包含海藻糖,体内实验(In vivo)是否会对动物产生影响? 海藻糖在不太可能影响体内实验。它已被批准作为一种辅料用于人类注射药物。研发系统使用的海藻糖来自酿酒酵母,经HPAE测定,其纯度至少为98.5%。


Prodots™蛋白与常规蛋白的区别? R&D Systems® Prodots™ 蛋白与常规蛋白在生物活性上没有差别。Prodots™小球是我司专利技术制备的蛋白小球。其可在培养基中立即溶解,无需重溶及分装,在4度条件下可保存6个月。避免了常规蛋白重溶及反复冻融可能造成的蛋白损失及繁琐的实验操作,保证了蛋白质的生物活性。此类产品有多种规格,最小规格为5ug,可以满足不同研究人员的需求。 更多详情请参考https://www.rndsystems.com/cn/products/prodots?%3B%3B=


Prodots™小球中的成分对细胞培养会有影响吗? Prodots™小球会在生产后进行评估以确认活性。在我们的实验中,我们没有观察到Prodots™除蛋白以外的其它成分对结果有影响。我们建议客户在此处查看信息:https://www.rndsystems.com/cn/products/prodots?%3B%3B=


   1.2 GMP蛋白


GMP蛋白与传统蛋白的区别通常,传统蛋白和GMP蛋白的序列、表达系统和基本生产SOP是相同的。与传统蛋白质相比,GMP蛋白质具有广泛的可追溯性文档,额外的质控测试和质量保证审查。 详情请见:https://www.rndsystems.com/products/gmp-quality-policy-and-regulatory-support


R&D Systems®的GMP Proteins 是否为Animal-free? 如果可能的话,R&D Systems® GMP蛋白可以使用大肠杆菌制备,生产过程完全无动物源。但是,有些蛋白质需要在真核系统中产生才能具有活性。这可能是由于这些蛋白质折叠或翻译后修饰只能通过真核细胞系来实现。在某些情况下,这些蛋白可以在无动物源认证的Sf9昆虫细胞系中成功表达(无动物成分ACFP)。通常,产品的页面及说明中明确说明了是否特定蛋白质的生产过程无动物源。


Animal-Free产品可以提供无动物源性证明材料吗? Animal-Free的产品COO中会明确标明:This product was produced in an animal component free process (ACFP)。如果需要书面的证明材料,可以提供客户信息及产品货号批号信息,由技术支持向总部申请COO。

GMP政策和法规相关文件 若客户由于生产或其它需要,我司可以提供产品的GMP政策和法规相关文件,具体请客户联系我们或者参考如下页面:https://www.rndsystems.com/products/gmp-quality-policy-and-regulatory-support


什么是药物主文件(DMF, Drug Master File)? Master File (DMF) 是由生产企业向FDA递交的涉及产品 /药品的详细保密信息文件,主要适用于美国。包括产品名称及描述、生 产和质控中所有关键步骤的详细制剂成分包含原材料特性其相内容记录、产品详述及包装等多项信息。这些可用于新药临床试验 (IND) 申请,生物制品许可(BLA), 新药申请(NDA) 或者仿制药申请(ANDA), 出口申请。 目前,在欧洲和中国没有与美对应的生物制品原料DMF系统。但是,由于CFDA对很多新型治疗药物/方案的规定尚不完善,有 FDA的认可以作为参考支持。 Bio-Techne正在对所有的 GMP 蛋白提交 DMF申请(目前已有4个注册完成)。


贵司产品能否提供无TSE/BSE证明,或者客户有何其他办法? 所谓TSE,是英文Transmissible spongiform encephalopathies的首字母缩写,即可传播性海绵体脑炎(TSE),包括绵羊和山羊患的痒病、长耳鹿和麋鹿患的慢性消耗疾病、牛海绵状脑病(BSE)和人类的苦鲁病和痉挛性假硬化(CJD)。 我司尚未进行特定产品有效去除TSE(可传播性海绵体脑炎)/BSE(牛海绵状脑病)的研究。因此,确认产品不含TSE/BSE在科 学上是不可能的。但是R&D Systems力求通过以下措施来将TSE/BSE 的污染风险减少到最低: 1.从被认为可忽略或可控制BSE风险的国家采购动物源材料 2.从我们的供应商处收集产地来源证书和TSE / BSE声明 3.对生产中使用的原材料进行全面检验和100%可追溯性 4.建立供应商资格认证和监控体系 5.产品批次特定的原产地证书 6.健全的质量管理体系。我们的工厂已通过ISO9001、ISO13485、ISO14001和MDSAP认证 7.控制内部生产设施和生产流程

如果客户需要寻求其他办法,目前检测TSE/BSE主要用ELISA方法,欧盟验证通过的ELISA检测试剂盒厂家有3家,Prionics, Bio-Rad和CEA,比较可靠的第三方检测机构是BioReliance。

   

1.3 Bioassay 生物测定实验


重组蛋白或天然蛋白在37°C下的培养液中半衰期是多少?如何测定? R&D Systems®不能确定培养基中重组蛋白或天然蛋白的半衰期。对于大多数生物活性分析,细胞与蛋白质的孵育时间为48到72 小时。但这并不意味着该蛋白质在整个孵育期间都具有活性。在某些生物测定实验中,需要48至72小时才能观察到效果。每个研 究人员都需要根据参考文献及自身预实验来优化每种蛋白质的孵育时间。 实验方法将取决于蛋白质和细胞的种类,细胞密度和培养条件。我司建议客户根据说明书规定的存储方式进行存储,并保证在说 明书规定的时间范围内的产品的质量。

蛋白活性是如何检测的,如何确定蛋白活性实验参考用量。 对于不同的蛋白产品,活性检测的方法不同。同一种蛋白产品,在不同的细胞上检测,所用的方法也是不同的。最终得到的ED50 值也不同。凡经过生物活性验证的蛋白产品,在我司产品页面均有活性验证信息,客户可在生物活性(Activity)一栏中查看使用的 细胞类型,ED50值,或功能性(functional)ELISA中的互作蛋白,KD值等信息。


蛋白产品可用于网站所列活性测试以外的其他应用吗? 说明书中的生物活性(Activity)一栏描述了R&D Systems®对蛋白质进行质量控制的方法。但每种蛋白质还有许多其它的使用方法。 我们的引用文献中,有蛋白产品在其它细胞或其它实验类型中的应用。请单击特定产品网页上的“引文”(Citation)选项卡以获取更 多信息。


为何ED50是一个范围? 生物活性实验是对蛋白质的生物学反应的一种测量。因此,生物活性实验中的任何变化也可能导致不同的结果。这种变化可能包 括细胞密度,细胞年龄,传代数,营养状况,培养基和所用的添加剂,以及实验操作者的操作手法。由于生物活性实验的可变 性,同一蛋白质在不同情况下可能不会产生相同的ED50。因此R&D Systems®的蛋白产品说明书上给出ED50是一个范围。


生物活性单位(Unit)和国际单位(IU)是否相同?能否与ED50换算? 蛋白质参考标准有多种来源。最常见的是美国NIBSC的WHO标准。参考蛋白质有限。当有标准品时,R&D Systems®将标准品与 重组蛋白在同一生物活性实验中进行比较。比较结果在官网发布,并提供与国际单位(IU)的转换值。 活性单位与ED50值之间的换算不是绝对的,因为国际单位并非仅仅来自生物活性测试,而且ED50值会随实验条件的轻微变化而 变化。确定正确剂量的最佳方法是,使用新批次与旧批次进行剂量反应平行(Side-by-side)实验。

蛋白的质量如何换算为单位及国际单位 我司以质量定义重组蛋白,有些酶类产品以单位(Unit)定义。需要注意的是,单位是在特定的环境下,使用特定产品进行反应来定 义的,不同产品及厂家定义不同。 目前重组蛋白有国际单位(IU)标准,我司的部分重组蛋白可以与世界卫生组织(WHO)标准(IU)换算,详情参考页面: https://www.rndsystems.com/cn/resources/technical-information/unit-conversion-table


如何测量酶活性? 当重组蛋白是酶时,酶的活性由酶促反应实验测定。测定每种酶切割底物的能力,比活以皮摩尔/分钟/微克表示。