biotechne产品使用常见技术问题解答- Immunoassay 免疫检测

3.1 Quantikine®, QuantiGlo™, Parameter™,Valukine™ ELISA 即用型ELISA


是否有Quantikine® ELISA 操作演示视频? 我司官方微信公众号RnDSystems(互动达人-操作视频)及Bilibili(UID:509961500)上均有相关的视频。


样本复孔之间的读值差异较大的可能原因? 同一次测试中出现复孔读值差异较大的两个主要原因与移液和洗板技术有关。有关改进ELISA数值不稳定的建议,请参阅: https://www.rndsystems.com/resources/troubleshooting-guide-elisa-development


ELISA实验使用贵司重组蛋白作为对照,为何检测结果与上样量不符? 我们对于重组蛋白的定量采用的是Coomassie或A280读数的方法。我们不用ELISA方法来定量重组蛋白。如果您想使用蛋白质制 作质控品,最好将蛋白质浓度视为未知,并通过ELISA中的测量值来确定有效质量,而不是使用标签上给到的蛋白质量。 ELISA kit的定量牵涉了标准品的校准,抗体对的识别,和各种基质效应的优化。另外,ELISA检测的值通常为pg/mL级别,而我们 的重组蛋白浓度多为ug/mL,因此此类实验需要大量稀释以将重组蛋白检测值落于标准曲线范围内。而大量的稀释步骤中错误校 准的移液器或任何移液错误都可能会导致不准确结果的放大。


添加样本稀释液(Assay diluent)会导致样品的进一步稀释吗? 由于Assay diluent添加到了所有孔中,标准品和样品处理方式相同。因此,可以从标准曲线计算出上样样品的浓度而无需调整考虑此稀释液的影响。


说明书建议500 rpm,0.12" orbit参数的摇床(shaker), 是否必须使用? 我司ELISA试剂盒说明书中的步骤都是经实验室开发优化后的标准化操作,可以保证产品的使用效果处于最佳状态,部分试剂盒中摇床的使用是为了促进及优化试剂与样本间的结合,有时是非常关键的步骤。 摇床的参数通常为转速500转/分钟,轨道半径0.12"(3mm)。我们强烈建议客户遵照说明书中的摇床规格使用,如果客户暂时没有,建议其向其他实验室借用或者另行购买,否则我们无法保证实验结果的准确性。我们有大量不按规定使用摇床或者使用错误参数的摇床导致结果不理想的案例。


Quantikine® Kits和DuoSet® Kits之间有何区别? Quantikine®即用型试剂盒经过全面优化,并针对产品说明书中列出的每种特定样品类型进行了验证。每个试剂盒可直接用于检 测,包含一个预先包被的96孔板,HRP标记的检测抗体和所有其它必需的试剂。这类试剂盒非常适合希望使用便捷的和优化好的 ELISA产品的研究人员。 Duoset® Kits是开发型ELISA试剂盒。它们仅包含捕获抗体、检测抗体、标准品和链霉亲和素-HRP。这些试剂盒通常只验证了细胞 培养上清液样品,针对对更复杂的样品(如血清和血浆)进行准确测量,需要进一步开发和验证。DuoSet® Kits为经验丰富的ELISA 用户提供了经济,灵活的替代方案。


QuantiGlo™以及Chemiluminescence ELISA检测参数如何设置? QuantiGlo™系列ELISA试剂盒属于化学发光免疫分析(Chemiluminescence analysis, CLIA)或者化学发光法(Chemiluminescence),与NOVUS的Chemiluminescence ELISA原理相同:使用过氧化物酶标记抗体,进行免疫反应后,利用鲁米诺作为发光 底物,在过氧化物酶和起动发光试剂(NaOH和H2O2)作用下鲁米诺发光,酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。 此类检测方法需要样本量低、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便。 需要注意的是: 1.与ELISA常用的比色法(Coloremetric)相比,化学发光法(Chemiluminescence)需要使用化学发光分析仪(Luminometer)检测,常见的参数设定:

1. 0 minute lag time; 0.5 sec/well read time; summation mode; auto gain on, or equivalent.

2. 不同化学发光分析仪获得的Relative light units (RLUs) 可能会有差异,需要根据仪器厂商的建议调节参数。

3. 在15分钟阅读窗口内,RLU值可能有波动,建议加入底物20-40分钟内进行检测。

4. 此类试剂盒还需要特定规格的摇床:Horizontal orbital microplate shaker (0.12" or 3 mm orbit) capable of maintaining a speed of 500 ± 50 rpm。


ELISA的标准品是用玻璃瓶装的,不担心吸附问题吗? 试剂盒中的玻璃瓶经特殊处理,能有效避免吸附效应。样本处理或者稀释时,切勿使用玻璃试管,以避免玻璃对蛋白的吸附造成的影响。


ELISA试剂盒内的试剂是否都需要室温平衡? 除非说明书中有明确标注,所有类型ELISA试剂盒检测前,都需要预先平衡至室温。


拟合ELISA标准曲线时,0点要计算吗?8或7点拟合是否有差异? 通常,ELISA的标准曲线是按照说明书建议,选择合适的拟合方法(4PL , Log-log或者线性等)通过软件生成。标准曲线拟合时需 要将0点(Blank)的值计算在内,标准曲线最低点至最高点的范围即试剂盒的检测范围。ELISA试剂盒由于开发设定差异,会存 在7点或者8点拟合的情况,通常拟合点越多,曲线越准确。


浓缩洗涤液(Wash Buffer Concentrate)为何会有结晶,该如何处理? 浓缩洗涤液为高度浓缩溶液,在低温情况下可能有结晶,属于正常现象;可将浓缩洗涤液平衡至室温,轻摇混匀,待结晶完全溶 解后再稀释为工作浓度的洗涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成500mL工作浓度的洗涤液,通常稀释后不 再会有结晶,未用完的洗涤液可以放回4 ℃保存。


客户样本结果值低于ELISA试剂盒的检测范围,数据是否可信? 由于ELISA是根据抗原抗体结合的原理,检测范围会有局限性,ELISA试剂盒的检测范围(标准曲线范围)是基于开发阶段大量可 靠数据确定的,不在检测范围内的结果,不可信。延长标准曲线只是一种理性状态,并不能用局限性的值去推断理想状态的结 果。建议更换更敏感的试剂盒,比如我们的高敏系列(HS)试剂盒,或者选择更灵敏的检测工具例如我司ProteinSimple®的Ella 全自动ELISA仪器。


3.2 DuoSet®, DuoSet® IC 开发型ELISA


购买DuoSet®通常需要搭配哪些其他试剂? 在说明书的Technical hints & limitations部分会告知需要搭配哪些试剂。部分试剂盒可以直接购买成套的辅助试剂盒,例如 DY007、DY008、DY009等,有些试剂盒则需要另行购买一些特殊组分进行搭配使用。


什么是DuoSet® IC? DuoSet® IC是一种开发型ELISA产品,IC是指Intracellular(细胞内),即此类试剂盒是用于检测细胞裂解液内胞内蛋白的DuoSet 开发型ELISA产品。一般包含: Capture Antibody 捕获抗体 Conjugated Detection Antibody 生物素偶联的检测抗体 Calibrated Immunoassay Standard 经校准的标准品 Streptavidin-HRP 亲和素偶联的辣根过氧化物酶 与Duoset®类似,DuoSet® IC需要配合辅助试剂及耗材例如酶标板,样本稀释液,洗涤液,显色液等进行ELISA系统的开发。


为什么有的抗体像是空管而别的抗体有明显的冻干粉? DuoSet®, DuoSet® IC试剂盒中的捕获抗体Capture antibody由于不含有BSA等载体蛋白,所以会呈现出不易察觉的“空管”假象, 类似CF版本的重组蛋白,这属于正常现象,请按照protocol正确重溶,放心使用。检测抗体(Detection antibody)通常加入了 载体蛋白,所以会有比较明显的肉眼可见的冻干粉。


DuoSet®, DuoSet® IC中使用的BSA的级别有何要求? 我们丰富的ELISA研发及售后经验表面,BSA的级别对ELISA实验影响很大,我们推荐至少98%以上纯度的BSA。我们建议使用与 DuoSet开发中使用的BSA级别相同或更高级别的BSA,例如Reagent Diluent Concentrate 1或2(货号DY995,DY997),或者 Probumin® Diagnostic Grade BSA (Millipore, 货号820451) 。


未经验证的样本例如血清血浆,如何确保其所测得值是准确的? 对于未经验证的样本,需要进行掺入回收与线性稀释(Spike/Recovery/Linearity)实验,以验证并优化ELISA体系,降低基质效 应,确保测得值的准确性,我们有专门的protocol供参考,您可以联系技术支持索取。此外我们的公众号也有较详细的介绍: https://mp.weixin.qq.com/s/c6GdM8Awk5okJ246x6sexA


洗涤液(Wash Buffer)为何会变黄,变黄之后对实验是否有影响? Wash Buffer含有ProClin 30。ProClin 300是一种防腐剂,用于诊断和研究试剂中,颜色从透明到淡黄色。随着时间的推移,黄色 会变得更加明显,在室温下比在2-8℃时出现得更快。经过我们大量检测比较及客户的反馈,这种颜色的变化对防腐剂的功效及实 验结果没有影响。


包被好抗体的酶标板(Coated plate)是否能够长期保存? 通常我们建议包被好抗体的酶标板板,在封闭后,尽快进行使用。 有一些客户使用了如下的包被方法,不过由于我们没有验证封闭后的酶标板板能够存放多久,所以不能保证一定有效,仅供参考:

1. 按照Protocol要求将酶标板包被捕获抗体过夜。

2. 洗涤酶标板 3. 使用含有0.05% NaN

3. 1% BSA,5%蔗糖的PBS封闭1小时(蔗糖有助于在干燥和储存过程中保持抗体的构象,叠氮化钠会抑 制微生物生长,但也会影响检测信号)。

4. 抽干封闭液,真空干燥,用干燥剂密封,在2-8°C储存。