biotechne产品使用常见技术问题解答-多因子

3.3 Luminex® Assay多因子分析

R&D Systems® Luminex® Assay与 High Performance Assay的区别 总的来说,Luminex® Assays和Luminex® High Performance Assays的灵敏度是相似的。Luminex® High Performance Assays由 精选的分析物组成不同的panel,这些panel经过了严格的测试和验证。 Luminex Assay有三百多种因子可供选择,可以让研究者组合出自己独有的panel,是最具有灵活性的产品。适用于大样品的初筛。 High Performance Assays中提供的稀释剂已经过优化,使在同一panel上的分析物均能得到最佳结果。High Performance Assays 是R&D Systems®提供的最精确、重现性最好、准确度最高的Luminex®检测试剂盒。Human Luminex® High Performance Assays 能够提供质控品,同时它也是市场上最好的多因子液相芯片产品,能够与同指标Quantikine® ELISA结果相比较。


是否有Luminex试剂盒操作演示视频? 您好,我司官方微信公众号RnDSystems(互动达人-操作视频)及Bilibili(UID:509961500)上均有相关的视频。


客户一个Luminex试剂盒做80个样本为何稀释液不够? 每个Luminex试剂盒包含1个96孔板。Luminex试剂盒开发时,为了实验的严谨,我们默认每个标准曲线点及样本为复孔上样,所 以一个试剂盒的稀释液足够支持40个样本。若需要稀释80个样本,客户在样品配制时需要进行相应的调整,避免不必要的样品及 稀释液浪费,比如当样本需要1:1进行稀释时,可以30ul样品与30ul稀释液混匀,而不用50ul样品与50ul稀释液混匀。但是一般情况下,为了减少误差提高实验的准确性,我们建议客户做复孔。


如何定制Luminex Assays以及我如何知道不同分析物间能否兼容? 您可以使用我司的Luminex®定制系统Luminex® Assay Customization Tool (https://www.rndsystems.com/cn/luminex/analytes) 进行在线定制时,若您选择的分析物放置在一起可能出现不兼容情况,则不会生成在同一个试剂盒中。若分析物组合针对特定样 本存在不兼容情况,则会出现黄色提示框,若有不清楚的可以联系我们的销售及技术进行咨询。


Luminex 提供的板子及试剂是否是一次性的? Luminex®一次实验可以不用掉整块板。如果只使用部分孔,我们建议在实验时覆盖未使用的部分,因为此板井不是可拆卸的条 状,所以需要覆盖以避免污染。并且已使用的孔不建议重复使用以避免交叉污染。


R&D Systems® Luminex系列产品质控(QC)内容包括哪些? Luminex High Performance系列是目前市场上Luminex 最准确试剂盒。Luminex Assay系列达到同行业标准。 QC一般测回收率、线性稀释度、天然蛋白检测准确度、检测特异性,整体试剂盒检测准确度等。通常High Performance系列产 品的说明书中会有各指标的QC数据,常规Luminex Assay不提供具体指标的QC数据。


Luminex ® High Performance Assay不同panel中的分析物能否一起使用? Luminex® Performance Assay的每个panel均针对panel内的分析物组合进行了缓冲液和试剂的优化,会存在同一个分析物在不同 panel中出现的可能,不过需要注意的是,不同Panel中分析物的标准曲线范围,对应样本及稀释建议可能不同。因此,不同的 Luminex® Performance Assay中的分析物不能组合使用。 Base kit只包含针对特定panel中分析物的标准曲线及缓冲液,与其他panel中的分析物不兼容。


R&D Systems® Luminex 试剂盒一般测的是可溶性蛋白吗? 是的,因为检测的样本类型(血清、血浆及细胞上清液)一般含有可溶性蛋白,对于组织或者细胞裂解液样本,我们的抗体也有可能 识别其中的膜蛋白,但是这方面我们没有测试过。


R&D Systems® Luminex检测与ELISA检测,样本的处理是否有区别? 两类试剂盒检测样本的处理方法大致相同,具体的样本处理方法在说明书中有详细描述。Luminex验证过的样本类型有限,主要是细胞上清液,血清及血浆,而不同ELISA试剂盒可能验证过更多的样本类型(尿液,乳液,唾液等),在针对未经验证的样本建 议客户进行掺入回收及线性稀释实验验证系统的准确性。


Luminex实验出现珠子(beads)数量低于50,可能的原因和解决方式? 珠子(beads)数低的可能原因有: 1.样品粘稠,未有效稀释。 解决方法:测定前,将血浆样品解冻,16,000 xg离心4分钟,或更长。用校准稀释液(Calibrator diluent)进行建议的稀释。 2.收集时微球未悬浮 读板前立即震荡微球溶液1min以重悬微球。 3.微球聚集或成团 解决方法:将微球混合浓缩液进行1000 x g离心30s,制备1X微球混合液前进行轻柔涡旋。 4.洗涤时,磁珠未落到微孔板底部 确定磁力架正确的结合在微孔板上, 洗板时磁力架应置于微孔板底部,弃去洗涤液前应静置1min。不要吸干,以防止磁珠丢失。 5.仪器未正确校准 解决方法:每周进行仪器校准,在实验当天使用验证试剂盒确定仪器功能运行正常。校准及验证见仪器使用说明。 6.微球收集数设定不正确 解决方法:设定微球收集数(events/microparticle)为50,保证微球数量收集充分以获得统计学准确结果。 7.针孔堵塞,针孔过高或者过低导致没有完全将beads吸到 解决方法:清洗针孔或者调整针的高度至合适位置,清洗过程请参考:https://www.rndsystems.com/cn/resources/faqs/luminex-instrumentation 8.系统超时(针对Luminex® 100/200™ 和FLEXMAP3D™) 解决方法:在使用基于流式细胞术的仪器如Luminex® 100/200™时,如果仪器超时(timed-out),请停止运行。确定进样针的高度 并选择正确的微球类型,重新读板。因为仪器指定收集50个微球,超时可能导致针对某个或多个分析物微球计数不够。MagPix® 仪器针对每个因子的读取时间固定,不会有超时提示功能。



3.4 Proteome Profiler Array固相抗体芯片



固相抗体芯片(Proteome Profiler Array)的原理是什么? 固相芯片是利用抗原抗体结合原理,在PVDF膜上包被捕获抗体,配合相应的检测抗体,及缓冲液,显色液体系,构建的抗体芯片 检测系统。可同时检测样品中15~119种蛋白。结果类似多个Dot Blot,但具有很高的重复性和灵敏度。


固相抗体芯片是否可以定量? 不可以,固相抗体芯片是用来筛选样本中是否同时表达多项因子,如果使用不同的膜检测相同的样本和部分相同的因子,所测得 的点的亮度有可能是不一样的,因为亮度的多少还取决于抗体与靶标因子的亲和力。


参考点(Reference Spots)有什么作用,能否作为内参? 在膜上的左边上下角各有一对参考点,在膜上的右边上角有一对参考点,可以根据其布局对膜上的点(靶因子)进行定位,避免 搞反方向。 这些参考点内包被了生物素化的蛋白,会与Streptavidin-HRP反应显色。需要注意的是,参考点内蛋白及其敏感,仅供实验指示 用,并不能作为内参使用。


如何检测固相抗体芯片? 步骤简述: Step1 样本准备:细胞/组织裂解,总蛋白定量 Step2 样本/芯片反应:芯片在封闭液中封闭1小时后,与样本2-8℃过夜孵育。 Step3 与捕获抗体孵育:结合了抗原的芯片,与捕获抗体室温孵育2h。 Step4 加入化学发光试剂反应1分钟 Step5 按照X-光片曝光/凝胶成像/近红外成像的方法,进行芯片的成像和数据分析。详情可以参考我司官方微信公众号RnDSystems (互动达人-操作视频)及Bilibili(UID:509961500)上相关的视频。


如何分析固相抗体芯片的结果? R&D Systems® 提供了Quick Spots 图像分析软件专用于固相抗体芯片的结果分析(https://www.wvision.com/QuickSpots.html )。 Quick Spots包含了固相芯片的专用模板,相比其他软件更方便快捷。请注意此软件需要购买,免费试用版只能得到结果不能导出。 此外,客户也可以用Quantity One或者Image J 软件,自行建立模板对各孔的灰度值进行分析。