如何解决原代细胞培养过程中的10大问题

来源:赛默飞

Q1

应如何进行冻存细胞的培养?


下列步骤以单管冻存细胞进行培养的实验方案为例。

  1. 准备一烧杯37°C的水。

  2. 从液氮储存中取出一管细胞,注意保护手和眼睛。

  3. 拧松管盖1/4圈,等待10秒钟以释放螺纹中可能残留的液氮,再重新拧紧管盖。

  4. 将冻存管的下半部分置于37°C水浴中进行解冻,直至冻存管内仅剩余一小块冰芯,使细胞迅速解冻。

  5. 用消毒液擦拭管体外表面,再将其移至II级A型层流细胞培养通风橱中。

  6. 打开管盖,使用1 mL移液器上下吹打细胞悬液以分散细胞。

  7. 从管中吸取20 uL细胞悬液,并将其稀释于20 uL台盼蓝溶液中(如:Gibco™台盼蓝,货号 15250-061)。

  8. 使用血细胞计数板来确定每毫升悬液中的活细胞数。

  9. 将管中悬液(1 mL)稀释至产品说明中的推荐浓度(例如1.25 x 10E4活细胞/毫升,Gibco™ 新生人表皮角质形成细胞)。

  10. 将5 mL细胞悬液加入25 cm2培养瓶,或将15 mL细胞悬浮液加入75cm2培养瓶中。

  11. 摇匀培养瓶中的培养基以彻底分散细胞。许多类型的细胞都会迅速贴壁,如果没有在传代后即刻摇匀细胞,细胞可能生长不均匀。

  12. 在37°C、5% CO2/95%空气、湿度细胞培养箱中培养细胞。为了获得最佳结果,培养开始后至少在24小时之内不要扰动细胞。



Q2

是否可以对扩增后的细胞重新冻存?如果可以该如何操作?


当从Thermo Fisher Scientific购买了Gibco™或Invitrogen™冻存或正处于增殖期的细胞,可对其进行扩增和重新冻存。不过,冻存操作可能会对细胞的生长状态有所影响。下列实验方案为您提供了一份使用Synth-a-Freeze™培养基冻存细胞的基础指南,Synth-a-Freeze™培养基是Thermo Fisher Scientific旗下的一款成分确定,无蛋白成份的冻存培养基。

请注意:由于冻存设备与个人技术之间的差异,我们无法保使用本方案冻存的细胞在复苏后能够保持活力,我们也无法为研究用户实验室冻存细胞的效果进行担保。

  1. 使用37°C水浴化冻Synth-a-Freeze™培养基或4°C条件下过夜化冻。

  2. 如果在水浴中进行化冻,请确保温度不要超过37°C,也勿将该产品延长时间置于37°C。

  3. Synth-a-Freeze™培养基在使用前应置于4°C条件下彻底平衡。为获得最优结果,推荐客户使用能够控制变温速率的冰箱。如果缺少能够控制变温速率的冰箱,也可使用细胞冻存盒(如Thermo Scientific™ Mr Frosty™ container)。

  4. 如需用酶试剂解离培养器皿表面的细胞,则需使用对应的终止溶液重悬细胞以中和酶的效果。

  5. 通过离心沉淀细胞。

  6. 去除上清液后,使用预冷的Synth-a-Freeze™培养基以5x10E5至3x10E6细胞/毫升的密度重悬细胞。

  7. 将细胞悬液分装至合适数量的冻存管中。

  8. 将细胞尽快冷却至4°C。

  9. 如果使用控制变温速率的冰箱:以每分钟降低1°C的速率冰冻样品,直至–40°C。之后按照每分钟降低2°C的速率降至–90°C左右。

  10. 如果使用细胞冻存盒:请按照说明书来准备冻存盒。

    为获得最佳结果,我们推荐您在细胞温度降至–80°C后,尽快将冻存管转移至液氮储存设备的气相中。

    作为Synth-a-Freeze™培养基的替代品,可使用该冻存细胞推荐的基础培养基,添加10%胎牛血清(FBS)和10% DMSO进行细胞冻存。请注意不推荐将Synth-a-Freeze™培养基用于人表皮黑素细胞的冻存操作。


Q3

是否需要在种板前离心细胞以去除冻存培养基?


我们不推荐在种板前离心细胞以去除冻存培养基。尤其是在不适当的高速条件下,离心对细胞有损伤。以我们Invitrogen™细胞培养实验室目前经验的来看,如果DMSO的浓度足够低,不会对细胞造成伤害。因此,我们的产品说明中提供了一份详细方案,其中包括如何使用推荐的接种密度和培养基的体积稀释细胞使得DMSO的终浓度低于0.4%(v/v)。



Q4

群体倍增数与传代数目之间的区别是什么?


群体倍增是培养体系中细胞总数的翻倍过程,在指数或“对数”生长期最为常用。


传代数目是指将细胞群体从培养容器中取出和传代的次数,这是为了将细胞保持在足够低的密度,以促使其进一步生长。在Invitrogen™细胞培养的定义中,组织分离得到的细胞的首代培养物称为原代培养。首次传代后的细胞称为第二次培养物(或第1次传代, passage 1)。第二次传代后的细胞则称为第三次培养物(或第2次传代,passage 2),以此延续下去。



Q5

为何我的原代细胞生长变慢或停止生长?


原代细胞未经永生化处理,因此群体倍增次数有限。每一种细胞类型都拥有不同的最大群体倍增次数,这一参数可在产品指定批次的COA(certificate of analysis)上找到。



Q6

粘附细胞培养与悬浮培养之间有何区别?


您正在使用不含动物源性成份(AOF)的添加剂来培养细胞,请确保使用了包被基质试剂盒。AOF添加剂中不含粘附因子,而包被基质试剂盒能够为细胞提供所需的粘附能力。


Q7

为何我的细胞无法依附于培养板/培养瓶表面?


从冰箱中取出血清并在2–8°C条件下过夜融化。随后可在室温下完成解冻过程。在这一过程中,血清应规则地进行混匀。


警告:不要将FBS置于37°C条件下孵育过长时间,否则产品可能会变混浊。由于血清中许多成份存在敏感性,其性能也可能受到影响。产品一旦解冻,建议您立即使用。



Q8

为何我的原代细胞复苏后存活率如此之低?


收货后立即将细胞保存于气相液氮中很重要。这些冻存管并不能确保不发生渗漏,将它们浸入液氮的液相中可能会使液氮渗入管中,进而影响细胞活力。



Q9

在角质形成细胞培养物中观察到大型扁平的烤饼样细胞。这是什么类型的细胞?


这些是衰老细胞,它们在成体角质形成细胞培养物中很常见。通常情况下培养物中会有一群衰老而不再增殖的细胞。而年轻细胞的个体更小,仍能够继续分裂。当培养物逐渐衰老,您就会观察到越来越多的大细胞,培养物最终也将停止生长。在正确培养和维持的情况下,这些培养物至少能够完成25次的群体倍增生长。



Q10

在复苏角质形成细胞后将他们种在少量培养瓶/培养板中,现在观察到里面有许多漂浮的细胞。为何会发生此种情况?


在接种细胞之前,请务必进行一下细胞活力计数,并按照推荐的接种密度进行接种。一些实验方案中提及的培养瓶数量是一个参考指标,您可据此估计每一管冻存细胞大致需要多少个培养容器。管子上的细胞数量是最低保证,,但一般都会多提供一些以确保您能收到我们承诺的细胞数量。也就是说,细胞计数对于保障准确的接种密度是至关重要的,这样您也就可以有效监控细胞生长的群体倍增次数了。



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