如何分离小鼠脾脏获得单细胞悬液

工具/原料

活体小鼠（6-8周龄正常小鼠）

小鼠解剖器具

PBS溶液或HBSS加2%FBS

推荐培养基：EasySep buffer（20144）或PBS加2%FBS加1mM的EDTA

细胞筛（70um）

培养皿、注射器

细胞培养瓶、离心管

常用移液管及移液枪

方法/步骤1:

颈椎脱臼法处死小鼠，75%乙醇浸泡5分钟，取出小鼠置于无菌操作台上，左腹侧朝上。解剖小鼠腹部，扒开内脏，可看到如图所示的长约3-4厘米呈长条状的深红色组织，即为脾脏；

方法/步骤2:

将脾脏组织转移到 35 mm 无菌培养皿（产品号 #27100/27150）中。后续如需进行细胞分选，在培养皿中加入 5 mL 推荐培养基（请参阅试剂盒产品说明书）。如解离组织后不需细胞分选，请在培养皿中加入含 1 mM EDTA 的 PBS。 注意：如同时处理多个脾脏样本，需使用 100 mm 培养皿（产品号 #27125/27127），并加入 10 mL 培养基；

方法/步骤3:

去除脾脏组织上的结缔组织或脂肪，注意坏死区域，并检查脾脏是否有肿大、变色或病变。记录起始样本的状态对于后期评估细胞非常重要；

方法/步骤4:

从 3 cc 无菌注射器（产品号 #28230/28240）中取出活塞/柱塞。使用扁平的末端部分以温和画圆的方式研磨脾脏 5 次。这样可以破坏脾脏和髓质，释放脾细胞；

方法/步骤5:

将一个 70 μm 细胞过滤器（产品号 #27216/27260）置于 50 mL 无菌锥形管上，并用 2 mL 推荐培养基润洗滤网。 注意：细胞可能会黏附于干燥的滤网上，润洗滤网可以减少这种情况；

方法/步骤6:

使用润洗过的 5 mL 或 10 mL 移液管将脾细胞吹打均匀；

方法/步骤7:

将上清液和组织从培养皿转移至润洗过的 70μm 细胞过滤器（产品号 #27216/27260）。使用一个新的 3 cc 无菌注射器的活塞/柱塞，以温和画圆的方式使细胞和组织通过滤网。用 3 mL 推荐培养基冲洗滤网；

方法/步骤8:

离心 300 x g，10 分钟来收集细胞。弃去上清, 轻轻敲击试管重悬细胞。如有需要，可在试管中加入 40 mL 推荐培养基，进行第二次洗涤。重复这个步骤

方法/步骤9:

脾细胞可用于下游应用。使用stemcell磁珠分选试剂盒，无需去除红细胞！有核细胞计数。