外泌体收集和预处理

分析前阶段的许多因素都会影响外泌体的回收率。因此，计划好相关实验程序,从而尽可能地增加可报告参数至关重要。

(一)细胞分泌的外泌体

(1) 从条件培养基中分离和鉴定外泌体前，必须对释放细胞、培养和收获条件进行基本规定,培养和收获条件要做到可复制。例如，传代次数(或悬浮细胞的培养天数)、播种密度、收获密度(及任何相关的融合后特征)、培养体积、培养容器或生物反应器系统、氧气或其他气体张力(如果它们与标准细胞培养条件不同)、刺激处理及收获频率和间隔等。建议定期确认细胞身份(如短串联重复分析)，必要时进行细胞谱系和种源鉴定。

(2) 定期检查支原体(或其他微生物)必需的。因为细胞对污染物会有不同程度的反应，而且有的污染物也可以释放外泌体从而干扰实验结果。

(3) 收获外泌体时，应量化调亡细胞和坏死细胞的百分比(注意，当用高浓度的外泌体处理细胞时,细胞黏附的外泌体对凋亡标志地志物反应呈阳性,这可能会影响检测结果)。应酌情报告细胞的其他相关特征，包括活化状态、恶性状态和衰老状态。

(4) 样本在进行预处理时，必须确保有效去除了所有与实验无关的膜结构及细胞碎片，分离得到细胞上清液后应尽快进行外泌体分离操作。

(5) 实验过程需要提供培养基的组成和制备细节。特别要注意可能含有外泌体的介质成分，如血清。理想情况下,外泌体是在没有胎牛血清、来自其他物种的血清或其他复杂成分(如血小板、垂体提取物、胆盐)的介质中获取的。添加剂如葡萄糖、抗生素和生长因子都会影响外泌体的产生和组成，当不可避免地使用这些添加剂时，应增加一个非条件培养基作为质控，以评估培养基本身的作用，并且必须明确培养历史(如何和何时转换到无血清培养基)。

(6) 使用前应仔细检查产品的“无外泌体”性质。

(二)体液外泌体

(1) 采集标本时须严格按照采样规范操作的要求进行。分离外泌体时必须考虑到,每种体液都呈现出特定的生物、物理和化学特性，应准确识别标本状态以避免标本性状变化导致的实验失败。

(2) 举例说明血液衍生物的考虑因素，以血浆为例,其需要考虑的因素有供体年龄、性别、妊娠史、更年期、餐前/餐后状态(禁食/非禁食)、一天中的收集时间(昼夜变化)、最后一次运动的运动水平和时间、饮食、体重指数、特定的传染病和非传染性疾病、药物和其他因素。

(3) 技术因素包括样本收集量、第一管丢弃物、容器类型、处理时间、抗凝血剂的选择、是否混匀、温度(储存和加工)、运输、处理前管是否保持竖直，准确的离心或过滤程序、溶血程度、储存前血小板及脂蛋白的耗竭和其他参数，这些都应清楚说明。

(4) 除某些血浆/血清特异性(如血小板清除和凝血)考虑因素外，上述收集条件的技术细节适用于所有体液。

(三)组织外泌体

(1) 适用于细胞和体液分析前研究的许多影响因素也适用于组织样本。组织来源的样本需严格表征多个阴性标志物,尤其要确保回收的囊泡是来自细胞外的小泡，而不是细胞内收获、加工(如机械破坏)或储存(如冷冻)期间细胞破裂释放出来的颗粒。

(2) 在大脑这样的组织中收集外泌体尤其具有挑战性,因为在该类型组织中,类似的实验操作程序被用来收集突触体。这要求研究人员对组织要进行温和的处理和进一步分离纯化(目的是在不破坏细胞的前提下,将外泌体从细胞和细胞外基质中分离出来)，然后对多个阴性标志物进行严格的鉴定,从而使组织来源的外泌体更具说服力，使用转基因模型来追踪特定细胞的外泌体释放也是一种有效的方法。

二、外泌体储存

基质(如条件培养基、体液、组织)和分离后外泌体的储存条件都可能影响EV的特性,如稳定性、聚集性、颗粒数目和功能。无论是4℃还是-80℃保存都会在一定程度上影响外泌体的产量,并且长时间储存会影响外泌体的表面特征、形态特征、蛋白含量及后续分析，所以为了保证外泌体蛋白含量和功能,建议最好在收集样本后立即分离提取外泌体并进行分析。根据现有情况来看，目前还没有完全形成外泌体样本保存共识，在这里介绍一下常见标准。

(1) 用于外泌体研究的样本首选现抽现用。

(2)国际血栓和止血学会( Intemational Society on Thrombosis and Hemostasis,ISTH)推荐柠檬酸三钠盐用于外泌体研究,不提倡使用肝素类抗凝药物，肝素可能导致PCR假阴性，还能结合外泌体,阻断细胞对外泌体的摄取，因此还应记录患者的肝素治疗情况。

(3) 高度纯化的外泌体在储存时可能会附着在储存容器的表面，因此建议使用硅化容器进行储存,防止外泌体附着在表面而丢失。

(4) 用于分离外泌体的样品中禁止加入任何RNA保护剂(如Trizol)。

(5) 用于分离外泌体的全血样本不可冻融，且取血后必须当日进行血浆或血清的制备。

(6) PBS是重悬的标准选择。

(7) 目前的共识一般支持将外泌体存储在-80°C温度下 ,注意要避免反复冻融。

(8) 已分离好的外泌体祥品若需要进行电镜观察，必须冰上或4°C条件存放,且存放时间不能超过2天，不可冷冻保存，否则后续会影响电镜鉴定和观察效果。