eBioscience  流式细胞术细胞表面抗原的染色

武汉安特捷翻译,如有疑问,请参看原版说明书

eBioscience

流式细胞术细胞表面抗原的染色

仅用于研究


■   方案A:细胞悬浮液

■   方案B:人全血裂解液


简介


流式细胞术是能同时测量多个单粒子物理特性(如细胞)的一种有用工具。细胞列纵队通过激光束。当每个细胞通过激光束时,流式细胞以记录细胞或微粒的散射光、入射光和发出荧光。使用这个流式细胞仪分析方案,可以在单细胞水平执行表面分子的同步分析。


注意事项


1、为获得最佳性能的荧光染料结合抗体,抗体请避光储存于4°C。

无需冷冻。

2、使用之前,快速旋转抗体瓶以恢复到最大体积。我们不推荐涡流震荡抗体瓶。

3、方案除特殊说明外,所有染色应该在冰上或在4°C下避光进行。

4、相关eFluor®纳米晶体(NC)试剂染色方案的修订在以下方案中用黑体文字标记。


相关网站


Mario Roederer的主页(http://www.drmr.com/compensation/index.html

Mario Roederer是流式细胞术领域的关键领导者。


普渡大学血细胞计数实验室(http://www.cyto.purdue.edu/index.htm

流式细胞术的基础公共论坛由普渡大学维护。


方案A:细胞悬浮液


材料

12 x75mm圆底试管或96孔圆底微量滴定板

一抗(直标或纯化)

二级试剂,如有必要(间接染色法)

亲和纯化抗小鼠CD16/32 (eBioscience Cat. No. 14-0161)

亲和纯化人FcγR 结合抑制剂 (eBioscience Cat. No. 14-9161)

eBioscience® 流式细胞染色缓冲液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)

eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液 (eBioscience Cat. No. 00-3222)

7-AAD活性染色液 (eBioscience Cat. No. 00-6993) 或碘化丙啶染色液 (eBioscience Cat. No. 00-6990)


实验步骤


1、按第一部分——细胞制备中所描述的准备细胞。染色板包括纳米晶体试剂,细胞应该重悬于 eFluor®NC流式细胞染色液中并达到细胞终浓度为2x107/mL。

2、(选做)封闭非特异性的Fc受体交叉反应

a) 对于小鼠细胞:在染色之前细胞用浓度为0.5-1μg/100μL的纯化的抗小鼠CD16/CD32,于冰上预先孵育20min

b) 对于人体细胞:在染色之前细胞用浓度为20μL /100μL亲和纯化的人 FcγR 结合抑制剂,于冰上预先孵育20min。

3、每个小管或小孔中加入能被50μL整除的细胞悬浮液。

4、结合每个一抗的推荐用量加入到适量体积的流式细胞染色缓冲液 (eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液) 中至终体积为100μL (即50μL细胞样品+ 50μL抗体混合),并加入到细胞中。脉冲涡流轻轻混合。

用于直接结合的抗体:

5、冰上或4下避光孵育至少30min

用于纯化的抗体:

6、冰上或4下避光孵育至少60min。

注意:一些抗体需要非标准化的孵育条件,这些条件会在抗体技术数据表上标明。

7、通过加入流式细胞染色缓冲液(eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)清洗细胞。小管中2ml或者微量滴定板每个小孔200μL。300 - 400 xg,4°C离心5min收集细胞。重复两次洗涤,弃上层洗涤液。

用于直接结合抗体:

8、如果所有用于染色的抗体都是直接结合荧光染料,这些细胞可直接在流式细胞染色缓冲液(eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)中重悬。

用于纯化的或生物素结合的抗体:

9、如果用的是纯化或生物素结合一抗,下一步需添加适当的荧光标签试剂稀释于包含细胞的100μL流式细胞染色缓冲液(eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)中,冰上或4°C下避光孵育15 – 30min。

10、用流式细胞染色缓冲液(eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)清洗细胞。小管中加入2mL或者微量滴定板中每个小孔200μL。300 - 400 xg,4°C离心5min收集细胞。重复两次洗涤,弃上层洗涤液。

11、在流式细胞染色缓冲液(eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)中重悬染色细胞。

12、(选做)加入活性染料,7-ADD5 μL/样本)或PI(5 μL/样本)于样本中以便在分析中排除死细胞。

13、在流式细胞仪上获得分析数据。


方案B:人全血裂解液


注意事项


1、eBioscience 提供两种流式细胞术中分析全血样本的溶液。eBioscience® 1X RBC Lysis Buffer 仅溶解样本中的活体红细胞以供分析,然而1-step Fix/Lyse Solution 不仅能溶解红细胞,还能固定样本。

2、这个方案应用于在RBC细胞溶解之前的流式细胞仪全血染色液。或者,在染色之前分装的全血裂解液,每100μL的血液中加入2ml的裂解液(eBioscience® 1X RBC Lysis Buffer or 1-step Fix/Lyse Solution)。

3、如果细胞在染色前用1-step Fix/Lyse Solution分装,你需要确认在染色板上的抗体能够识别固定在表面的抗原。


材料

eBioscience® 1X RBC Lysis Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4333) or 1-Step Fix/Lyse Solution (eBioscience Cat. No. 00-5333)

12x75mm圆底试管

一抗(直标或纯化)

二级试剂,如有必要(直接染色)

亲和纯化人FcγR结合抑制剂(eBioscience Cat. No. 14-9161)

eBioscience® 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-4222)

eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-3222)


实验步骤


1、每个小管或小孔中加入能被100μL整除的血液。

2、(选做)在染色之前细胞以每100μL血液中加入20μL的亲和纯化人FcγR结合抑制剂于冰上或4下孵育20min。

3、结合每个一抗的推荐用量加入到适量体积的流式细胞染色缓冲液(eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)中至终体积为50μL。并加入到细胞中,涡流轻混。

4、冰上或4下避光孵育20-30min.

注意:一些抗体需要非标准化的孵育条件,这些条件会在抗体技术数据表中标明。

5、无需清洗细胞,每个管中加入2mL 常温1X RBC Lysis Buffer或1-Step Fix/Lyse Solution(微量滴定板上的每个小孔200μL),轻轻吸量以及短暂脉冲涡旋。室温避光孵育15min。在红细胞裂解液中孵育不要超过15min。

6、300-400xg 4离心样品5min,弃上清。

7、用流式细胞染色缓冲液(eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)清洗细胞两次。小管中2ml或微量滴定板每个小孔200μL。300-400xg ,4离心5min收集细胞。

用于直接结合的抗体:

8、如果所有用于染色的抗体可以直接与荧光染料结合,细胞可以直接重悬在流式细胞染色缓冲液(eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)中。

用于纯化或生物素结合抗体:

9、如果用的是纯化或生物素结合的一抗,下一步中需加入合适的荧光标签试剂溶解到100μL流式细胞染色缓冲液(eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)中并加入到细胞,冰上或4下避光孵育15-30min。

10、用流式细胞染色缓冲液eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)清洗细胞。小管中2ml或微量滴定板每个小孔200μL。300-400xg ,4离心5min收集细胞。重复清洗两次,弃上层洗涤液。

11、在流式细胞染色缓冲液(eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液)中重悬染色细胞。

12、(选做)用1X RBC Lysis Buffer溶解细胞的同时添加一个可行性染料至每个样本中,要么是7-AAD(5μL /样本)或是PI(5μL /样本),以便在分析中排除死亡细胞。

13、在流式细胞仪上获得分析数据。




亲和纯化抗小鼠CD16/32(eBioscience Cat. No. 14-0161)

亲和纯化人FcγR结合抑制剂(eBioscience Cat. No. 14-9161)

eBioscience® 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-4222)

eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-3222)

7-AAD活性染色液(eBioscience Cat. No. 00-6993) 或碘化丙啶染色液(eBioscience Cat. No. 00-6990)

eBioscience® 1X RBC Lysis Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4333) or 1-Step Fix/Lyse Solution (eBioscience Cat. No. 00-5333)

亲和纯化人FcγR结合抑制剂(eBioscience Cat. No. 14-9161)

eBioscience® 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-4222)

eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-3222)