eBioscience 流式细胞内抗原染色的操作流程

武汉安特捷翻译，如有疑问，请参看原版说明书

eBioscience

流式细胞内抗原染色的操作流程

仅用于研究

·方案A：胞内蛋白染色

·方案B：核内抗原染色

介绍

基本免疫荧光染色和流式细胞分析技术的进步可用于表面分子和细胞内的抗原在单细胞水平的同时分析。在本操作中，细胞首先根据表面抗原染色方案进行表面抗原染色，然后用甲醛固定细胞膜，洗涤剂皂素透化，以允许抗细胞因子抗体进行细胞内染色。在细胞体外刺激细胞通常需要通过流式细胞术检测细胞因子，因为细胞因子水平通常在静息时比较低。用适当的试剂刺激细胞，将取决于细胞类型和实验条件。例如，刺激T细胞产生IFN-γ，TNF-α，IL-2和IL-4，需要使用PMA（12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇）和Ionomycin（钙离子载体）的组合，或抗CD3抗体。刺激单核细胞产生IL-6，IL-10或TNF-α，可以使用LPS（脂多糖）。

注意：对于给定的细胞因子诱导的最佳刺激条件是可变的，并且必须凭经验确定。例如，对于检测IL-6的产生由人LPS活化的单核细胞的细胞最佳时间为6小时，而IL-10的检测需要刺激至少24小时。

与通过ELISA检测分泌型细胞因子相比，通过流式细胞术在检测胞内因子的最后几小时刺激时，有必要用蛋白转运抑制剂阻断细胞因子的分泌，比如Monensin或Brefeldin A。建议在特定的试验系统中评估不同的蛋白转运抑制剂。

用于固定和破膜缓冲液可以对胞内染色具有不同的影响。ebioscience提供Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience Cat. No. 00-5523) 或 IC Fixation Buffer (eBioscience Cat. No. 00-8222) 和 Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)。请联系技术支持获得更多资讯。

注意事项

1. 无论您选择哪种荧光染料直标抗体，请避光放在4℃，不要冻存。

2. 使用前，快速旋转抗体管让其恢复至最大体积，我们不推荐涡旋震荡抗体管。

3. 除了注意说明书上的操作，所有的染色步骤需要在冰上或4℃进行并尽可能避光。

4. 关于eFlour系列染料的相关使用在Protocol 中用粗体标注（方案 B中推荐了更好的信号强度）

5. 固定破膜步骤是检测细胞内抗原必须的，光的散射会增加非特异性背景染色，包括额外的蛋白，比如BSA和FCS的缓冲液可以帮助减少非特异性背景染色。

方案A：胞内蛋白染色

下列操作能在单细胞水平同时分析细胞表面分子和细胞内抗原。在本操作中，固定之后破膜，这需要破膜缓冲液一直存在于后续步骤中，以便让抗体进入细胞质，同时让未结合的抗体离开细胞。因此，所有的胞内染色都必须在破膜缓冲液存在的情况下进行。建议在检测单个细胞的细胞质蛋白、细胞因子或其它分泌蛋白时使用此操作流程。对于细胞因子的检测，合适的刺激条件和细胞因子的产生因细胞类型和细胞因子的不同而不同。在体外刺激细胞，需要注意用蛋白转运抑制剂阻断细胞因子的分泌，比如Monensin Solution（eBioscience Cat. No.00-4505）或Brefeldin A Solution （eBioscience Cat. No.00-4506），如果是核内蛋白因子，请参看Protocol B

材料

· 12×75mm 圆底检测管

·（选用）Fixable Viability Dye eFluor® 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), Fixable Viability Dye eFluor® 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864) or Fixable Viability Dye eFluor® 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)

· 细胞内蛋白的直标抗体

· IC fixation buffer (eBioscience Cat. No. 00-8222)

· Permeabilization Buffer（10x）(eBioscience Cat. No.00-8333)

· Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)

· eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-3222)

缓冲液和溶液制备

在使用前用蒸馏水稀释10x的Permeabilization buffer，制备1x工作液。每个样品需要6.5ml Permeabilization buffer工作液

实验步骤

1. 准备感兴趣的细胞，以检测细胞内蛋白。请参考eBioscienc网站上的Best Protocols：Cell Preparation for Flow Cytometry。

2. （选做）为了避免死细胞污染而造成的假象，我们建议使用Fixable Viability Dye来排除分析中的死细胞。

3. 按照Best Protocols“Staining cell surface antigens”中的操作，对细胞表面抗原染色

对于染色板，包括纳米试剂，细胞应悬浮在eFluor®NC流式细胞仪染色缓冲液进行染色。

4. 在最后一次洗涤之后，弃上清，涡旋振荡样品，以彻底分离沉淀。（通常还有100μl残留）

5. 加入100μl IC fixation Buffer固定细胞，涡旋振荡。

使总体积为约200微升用于固定将导致从该纳米晶体试剂的最佳荧光信号。

6. 室温避光孵育20min。

7. 无需洗涤，在每管中加入2ml 1×Permeabilization buffer。

8. 室温300-400xg离心样品5min，弃上清。

9. 用2ml 1×Permeabilization buffer重悬细胞沉淀。

10. 室温300-400xg离心样品5min，弃上清。

11. 用100μl 1×Permeabilization buffer重悬细胞。加入推荐用量的荧光标记抗体已检测细胞内抗原，室温避光孵育20min。

注：eFluor®纳米试剂长时间暴露于透化缓冲液将显著降低eFluor®纳米晶体的荧光强度，因此，建议严格遵守推荐的孵育时间。

12. 在每管中加入2ml 1×Permeabilization buffer。

13. 室温300-400xg离心样品5min，弃上清。

14. 在每管中加入2ml Flow Cytometry Staining Buffer。

15. 用适量的Flow Cytometry Staining Buffer重悬染色后的细胞，上流式细胞仪分析。

Protocol B：核内蛋白

下列操作能在单细胞水平同时分析细胞表面分子和细胞内抗原，包括细胞核抗原。本操作将固定和破膜融合成一个步骤，不需要对细胞内抗原再使用Permeabilization Buffer。建议在检测细胞核抗原（如转录因子）时使用本操作，它同样适合许多细胞因子的检测。关于Foxp3 Fixation/Permeabilization buffer set (00-5523)与细胞因子抗体的兼容性，请在线查看缓冲液兼容性图表：http://www.ebioscience.com/resources/application/flow-cytometry/antibody-fixation-considerations.htm

材料

· 12X75圆底检测管

·（选用）Fixable Viability Dye eFluor® 450 (Cat. No. 65-0863), Fixable Viability Dye eFluor®660 ( Cat. No. 65-0864) or Fixable Viability Dye eFluor® 780 (Cat. No. 65-0865)

·（可选）Normal Mouse Serum (eBioscience Cat. No. 24-5544)

·（可选）Normal Rat Serum (eBioscience Cat. No. 24-5555)

· 细胞内蛋白特异的直接标记抗体

· Foxp3 Fixation/Permeabilization buffer set (00-5523)

· Flow Cytometry Staining Buffer (00-4222)

缓冲液和溶液制备

将Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate (1 份)与Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate (3 份)混合，制备新鲜的Foxp3 Fixation/Permeabilization 工作液。每个样品需要1ml Foxp3 Fixation/Permeabilization 工作液。

在使用前用蒸馏水稀释10× Permeabilization Buffer，制备1×工作液。每个样品需要4-5ml。

流式管制备样品的实验步骤

1. 制备感兴趣的细胞，以检测细胞内蛋白。请参考eBioscience网站上的Best Protocols：Cell Preparation for Flow Cytometry。

2.（选做）为了避免死细胞污染而造成的假象，我们建议使用Fixable Viability Dye来排除分析汇总的死细胞。

3. 按照Best Protocol Staining Cell Surface antigens中的操作，对细胞表面抗原染色。

4. 在最后一次洗涤之后，弃上清，涡旋振荡样品，以彻底分离沉淀。

5. 在每管中加入1ml Foxp3 Fixation/Permeabilization工作液，涡旋振荡。

6. 将管子置于暗处，在4℃或室温下孵育30-60分钟。（小鼠样品在4℃下于暗处最多可孵育18h。）

7. 无需洗涤，在每管中加入2ml 1×Permeabilization。

8. 在室温下以300-400g离心样品5分钟，然后弃上清。

9.（可选）重复第8-9步。

10. 用100ul 1×Permeabilization Buffer重悬细胞。（这是弃上清后通常的残留体积量）

11. 可选用2%正常小鼠/大鼠血清封闭，即在细胞中直接加入2ul血清。室温孵育15min。

12. 无需洗涤，加入推荐用量的荧光标记抗体，以检测细胞内抗原，室温避光孵育至少30min。

13. 在每管中加入2 ml 1×Permeabilization Buffer。

14. 室温以300-400×g离心样品5min，弃上清。

15. 在每管中加入2ml 1×Permeabilization Buffer 或 Flow Cytometry Staining buffer

16. 室温以300-400×g离心样品5min，弃上清。

17. 以适量的 Flow Cytometry Staining buffer重悬染色后的细胞，上流式细胞仪分析。